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      AB11L234-G418(遺傳霉素)

      簡(jiǎn)要描述:AB11L234-G418(遺傳霉素),也稱(chēng)作Geneticin (遺傳霉素)、G418、G 418或者G-418,是一種結構類(lèi)似于慶大霉素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷類(lèi)抗生素,來(lái)源于Micromonospora rhodorangea,常用于篩選表達neo基因的真核或原核多克隆或單克隆細胞。

      • 產(chǎn)品型號:
      • 廠(chǎng)商性質(zhì):生產(chǎn)廠(chǎng)家
      • 更新時(shí)間:2024-07-02
      • 訪(fǎng)  問(wèn)  量:1264

      產(chǎn)品分類(lèi)

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      AB11L234-G418(遺傳霉素),也稱(chēng)作Geneticin (遺傳霉素)、G418、G 418或者G-418,是一種結構類(lèi)似于慶大霉素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷類(lèi)抗生素,來(lái)源于Micromonospora rhodorangea,常用于篩選表達neo基因的真核或原核多克隆或單克隆細胞。

      G418不僅用于穩定細胞株的篩選,也用于穩定細胞株的維持。本產(chǎn)品的50mg/ml包裝經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌,可以直接用于細胞培養。

      在細菌、酵母、原生動(dòng)物、蠕蟲(chóng)、高等植物和哺乳動(dòng)物中,遺傳霉素通過(guò)抑制蛋白合成而抑制或殺死細胞。其作用機制為遺傳霉素能夠與70S和80S核糖體結合,從而阻斷肽鏈延伸,干擾蛋白合成。其抗性基因(主要為neo基因)位于轉座子Tn601 (903)或Tn5(來(lái)源于細菌),可以在真核細胞中表達。通過(guò)基因重組技術(shù)將這些抗性基因導入細胞,使細胞表達抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase, APH(3)II),從而獲得對G418的耐藥性,用來(lái)篩選和維持培養攜帶抗性基因的原核或者真核細胞。

      哺乳動(dòng)物細胞中,當抗性基因neo被整合進(jìn)真核細胞基因組后 ,編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase, APH(3)II)。此酶通過(guò)共價(jià)修飾G418的氨基或羥基功能,抑制抗生素-核糖體間的相互作用,從而使得抗生素失活。這一特性賦予細胞產(chǎn)生抗性而能在含有G418的選擇性培養基中生長(cháng)。進(jìn)行穩轉細胞株篩選實(shí)驗時(shí),需要建立劑量反應曲線(xiàn)(dose-response curve or kill curve)確定殺死無(wú)抗性細胞的zui低有效濃度。

      植物細胞中,通過(guò)轉染攜帶nptII基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶,這個(gè)酶使得多種抗生素喪失活性,包括 G418,卡那霉素和巴龍霉素。

      G 418與新霉素同為氨基糖苷類(lèi)抗生素,都可被Neo基因產(chǎn)物失活,因此都可以用于篩選攜帶Neo抗性基因的細胞,新霉素篩選的細胞都可以用G418替代。


      訂購信息


      產(chǎn)品名稱(chēng)

      貨號

      規格

      價(jià)格

      G418(遺傳霉素)

      AB11L234

      1 g

      550




      運輸與保存



      常溫運輸。4℃保存,有效期36個(gè)月。


      技術(shù)參數


      1.CAS:108321-42-2

      2.分子式:C20H40N4O10·2H2SO4  

      4.分子量:692.71

      5.純度:~98%
      6.結構式:

      AB11L234-G418(遺傳霉素)使用方法


      1.G418儲存液的配制(50mg/ml,活性濃度)
      (1)活力單位的換算
        根據此公式進(jìn)行換算:(1000/A0)×A1=A2,其中A0是G418的活力值(Potency),因批次而異,具體見(jiàn)瓶子的標簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實(shí)際稱(chēng)重的粉末與體積比濃度。
        比如若所用批次的G418 活力值為:750µg/mg,要配制50mg/ml的G418活性濃度,則實(shí)際要配制的粉末濃度為1000/750×50mg/ml=66.33mg/ml。
        如果配制10ml的G418儲存液(活性濃度,50mg/ml),則需要稱(chēng)取663.3mg粉末。
      (2)除菌和保存
        根據上述換算得到的實(shí)際粉末稱(chēng)重量,加入10ml無(wú)菌去離子水使其*溶解。
        先用5ml無(wú)菌去離子水預濕潤0.22μm針頭式過(guò)濾器,除盡水。之后使用此濾器過(guò)濾,除菌后分裝成單次使用的小量(如1ml)放到-20℃凍存,1年穩定。
      【注】:不要對混濁的溶液進(jìn)行過(guò)濾,因為混濁的溶液意味著(zhù)藥物未*溶解,過(guò)濾過(guò)程中會(huì )造成藥物損失,降低活性;不建議使用液體培養基,NaCl,磷酸鹽溶液或者有機溶劑來(lái)制備儲存液;配制G418溶液時(shí),一定要根據相應批次G418標注的活力值(potency)來(lái)進(jìn)行換算,從而得到需要活性濃度的儲存液以及工作液。
      2.建議使用濃度
        一般來(lái)說(shuō),剛開(kāi)始篩選轉化子需要高濃度的G418,并用一個(gè)較低濃度的G418維持培養。生長(cháng)條件,細胞類(lèi)型和其它的環(huán)境因素都可能影響G418的用量,因此第一次使用的實(shí)驗體系建議通過(guò)劑量反應性曲線(xiàn)(dose-response curve or kill curve),來(lái)確定最佳篩選濃度。
        通常情況,哺乳動(dòng)物細胞篩選范圍200-2000μg/ml;植物細胞:10-100μg/ml;酵母細胞:500-1000μg/ml。

      表1.部分哺乳動(dòng)物細胞的推薦工作濃度表。

      細胞名稱(chēng)

      細胞類(lèi)型

      濃度

      B16

      Mouse melanocytes

      400-1000μg/ml

      CHO

      Chinese hamster ovarian cells

      400-800μgμg/ml

      Hela

      Human uterine cells

      200-400μg/ml

      HEK293

      Human embryonic kidney cells

      200-500μg/ml

      THP-1

      Human monocytes

      250μg/ml

       

      3.遺傳霉素劑量反應曲線(xiàn)的建立
        遺傳霉素的有效篩選濃度跟細胞類(lèi)型、生長(cháng)狀態(tài)、細胞密度、細胞代謝及細胞所處細胞周期等因素相關(guān)。為了篩選得到穩定表達目的蛋白的細胞株,確定能夠殺死未轉染宿主細胞的遺傳霉素zui低濃度非常重要,對于初次使用的細胞,一般需要通過(guò)實(shí)驗來(lái)確定適合自身實(shí)驗體系的劑量反應曲線(xiàn)(dose-response curve or kill curve),曲線(xiàn)建立時(shí)至少應設置6個(gè)遺傳霉素濃度。遺傳霉素處理分裂期的細胞時(shí)活性*,因此在添加遺傳霉素之前需要先將細胞培養一段時(shí)間。
      (1)第一天:未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上,37℃,CO2培養過(guò)夜。
      注:對于需要更高密度來(lái)檢測活力的細胞,可增加接種量。
      (2)根據細胞類(lèi)型,設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細胞為例,可設定0、50、100、200、400、800、1000μg/ml。
      (3)第二天:去除舊的培養基,換用新鮮配制的含有相應濃度遺傳霉素的培養基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。更換培養基后在細胞培養箱中繼續培養。
      (4)接下來(lái)每3-4 d更換新的含藥物培養基。
      (5)按照固定的周期(如每2 d)進(jìn)行活細胞計數來(lái)確定阻止未轉染細胞生長(cháng)的恰當濃度。選擇在理想的天數(通常是7-10 d)內能夠殺死絕大多數細胞的zui低濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。
      4.穩定轉染細胞株的篩選
      (1)細胞轉染48h后,將細胞置于含有適當濃度遺傳霉素的新鮮培養基中培養,此為處理組。
      (2)【注】:當細胞處于分裂活躍期時(shí),抗生素作用zui明顯。當細胞過(guò)于密集,抗生素產(chǎn)生的效力會(huì )明顯下降,所以細胞的密度最好不超過(guò)25%。建議同時(shí)做一個(gè)正常細胞的對照組。轉染或感染48 h后,如果細胞過(guò)密也可以消化后重新接種細胞,培養過(guò)夜后即可進(jìn)行遺傳霉素篩選。每隔3-4 d更換含有遺傳霉素的培養液。

      (3)篩選7 d后觀(guān)察并評估細胞克隆(集落)的形成情況。對照組正常細胞應該100%死亡,處理組中存活的細胞為表達neo基因的細胞。根據宿主細胞種類(lèi)和轉染/篩選效率不同,集落的形成可能需要一周或者更多的時(shí)間。
      (4)克隆形成后,挑取并轉移5-10個(gè)抗性克隆于35mm細胞培養板,繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7 d。
      (5)之后更換正常培養基培養即可。


      注意事項


      1.本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗研究使用,不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

      2.用于細胞實(shí)驗,溶解后,須用一次性針頭濾器過(guò)濾除菌。

      3.本產(chǎn)品不可高壓滅菌。

      4.G418不要和其它抗生素/抗真菌劑(如青霉素/鏈霉素)共同使用,因為它們是G418的競爭性抑制劑。其它的抗生素也會(huì )產(chǎn)生交叉活性。

      5.G418加入培養體系中,未轉染的細胞有可能不會(huì )被殺死,原因在于藥物濃度過(guò)低,或者細胞密度過(guò)高。另外,快速分裂的細胞相對于緩慢增殖細胞,更容易被殺死。對照細胞(未轉染)可能在添加抗生素5-7 d后才能被殺死,轉染細胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14 d形成。

      6.即使加入有效劑量的G418,細胞可能會(huì )繼續分裂2-3次。G418的藥效通常在2 d后才變得明顯。

      7.本產(chǎn)品可能對人體有一定的毒害作用,請注意適當防護,以避免直接接觸人體或吸入體內。

      8.為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

      9.抗生素不穩定,請在有效期內盡快使用。

      10.以上數據均來(lái)自公開(kāi)文獻, 李記生物暫未本產(chǎn)品進(jìn)行獨立驗證, 僅供參考。


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